홍라이프 계산기효소 활성 계산기 쉽게 이해하기 — 개념과 원리
이 계산기는 분광광도계에서 읽은 분당 흡광도 변화(ΔA/min)를 mL당 효소 활성(U/mL)과 단백질 mg당 비활성(U/mg)으로 바꿉니다. 생화학 실험실의 동역학 분석, 특히 340nm에서 NADH나 NADPH 변화를 재는 분석에서 널리 쓰입니다.
계산 방법
분당 농도 변화 Δc = (ΔA/min) ÷ (ε × l)
큐벳 안의 활성(U) = Δc × 전체 부피
원액 활성(U/mL) = (ΔA/min × 전체 부피 × 희석 배수) ÷ (ε × l × 효소 부피)
비활성(U/mg) = (U/mL) ÷ (단백질 mg/mL)
- ε는 몰 흡광 계수(mM⁻¹ cm⁻¹), l은 광로 길이(cm), 부피는 mL, 희석 배수는 효소 시료를 묽힌 배수입니다.
- 1U는 1분에 기질 1µmol을 바꾸는 양이며 16.67nkat입니다.
원리
비어–람베르트 법칙에 따르면 흡광도는 농도에 비례합니다(A = εcl). 따라서 흡광도가 분당 일정하게 변한다는 것은 빛을 흡수하는 물질의 농도가 일정하게 변한다는 뜻입니다. ε를 mM⁻¹ cm⁻¹로 쓰면 속도가 mmol/L·min으로 나오며, 이는 mL당 분당 µmol과 같습니다. 여기에 큐벳 부피를 곱하면 분당 바뀐 물질의 양이 되고, 넣은 효소 부피로 나누고 희석 배수를 곱하면 원래 시료의 활성이 됩니다.
예제 풀이
기본값인 ΔA/min 0.150, ε 6.22mM⁻¹ cm⁻¹(340nm의 NADH), 광로 1cm, 전체 부피 1.0mL, 효소 0.05mL, 희석 10배, 단백질 2mg/mL로 계산합니다.
- Δc = 0.150 ÷ (6.22 × 1) = 0.02412mM/min = 분당 24.12µmol/L입니다.
- 큐벳 안의 활성 = 0.02412 × 1.0 = 0.02412U입니다.
- 희석 시료 = 0.02412 ÷ 0.05 = 0.4823U/mL입니다.
- 원액 = 0.4823 × 10 = 4.823U/mL이며, 80.39nkat/mL입니다.
- 비활성 = 4.823 ÷ 2 = 2.412U/mg 단백질입니다.
| 몰 흡광 계수 ε (mM⁻¹ cm⁻¹) | 원액의 효소 활성 (U/mL) |
|---|---|
| 1.55 | 19.29 |
| 3.11 | 9.646 |
| 4.67 | 6.431 |
| 6.22 | 4.823 |
| 7.78 | 3.859 |
| 9.33 | 3.215 |
| 12.4 | 2.412 |
결과 해석
비활성은 순도를 가늠하는 가장 좋은 지표로, 정제 과정에서 다른 단백질이 제거될수록 커집니다. U/mL 값은 반응에 효소를 얼마나 넣을지 정할 때 필요합니다. 기울기를 반응 초기의 직선 구간에서 구했고, ΔA/min이 광도계가 선형으로 반응하는 범위에 있을 때만 결과를 믿을 수 있습니다.
흔한 실수
- 효소를 넣지 않은 공시험(blank)의 기울기를 빼지 않는 경우
- 기질이 줄어들어 곡선이 휘는 구간의 기울기를 쓰는 경우
- ε 단위를 M⁻¹ cm⁻¹로 넣어 1,000배 오차가 나는 경우
- 효소 시료의 희석 배수를 빠뜨리는 경우
자주 묻는 질문
효소 1단위(U)는 무엇입니까?
정해진 조건에서 1분에 기질 1µmol을 바꾸는 효소의 양입니다.
카탈(kat)은 무엇입니까?
촉매 활성의 SI 단위로 초당 1mol이며, 1U는 16.67nkat입니다.
NADH에 6.22를 쓰는 이유는 무엇입니까?
340nm에서 NADH의 표준 몰 흡광 계수가 6.22mM⁻¹ cm⁻¹이기 때문입니다.
ΔA가 감소해도 됩니까?
됩니다. NADH를 소모하는 분석에서는 흡광도가 줄어들며, 기울기의 크기만 중요합니다.
출처: IUBMB Nomenclature Committee recommendations on enzyme units and the katal · B. L. Horecker and A. Kornberg, J. Biol. Chem. 175, 385 (1948)