홍라이프 계산기라이게이션 인서트:벡터 비율 계산기 쉽게 이해하기 — 개념과 원리
DNA 클로닝에서는 DNA 리가아제로 인서트 조각을 잘린 벡터에 연결합니다. 이때 성공률은 각 DNA의 질량이 아니라 벡터 분자 하나당 인서트 분자가 몇 개 있느냐에 크게 좌우됩니다. 이 계산기는 정한 양의 벡터에 원하는 몰비를 맞추려면 인서트를 몇 나노그램 넣어야 하는지 알려 줍니다.
계산 방법
인서트(ng) = 벡터(ng) × (인서트 길이 ÷ 벡터 길이) × 몰비
- 벡터 양은 반응에 넣는 선형화된 벡터의 질량(ng)입니다.
- 벡터와 인서트 길이는 염기쌍(bp) 단위입니다.
- 몰비는 벡터 분자 하나당 원하는 인서트 분자 수로, 3 : 1이면 3을 넣습니다.
원리
이중 가닥 DNA의 몰질량은 길이에 거의 비례합니다. 몰수는 질량 ÷ 몰질량이므로 벡터 몰수는 벡터 ng ÷ 벡터 bp에, 인서트 몰수는 인서트 ng ÷ 인서트 bp에 비례합니다. 인서트 몰수를 몰비 × 벡터 몰수로 놓고 풀면 위 식이 나오고, bp당 약 618 g/mol이라는 상수는 약분되어 사라집니다. 직관적으로 말하면 길이가 3분의 1인 조각은 분자 하나의 무게도 3분의 1이므로, 같은 개수를 넣으려면 질량도 3분의 1이면 됩니다. 인서트가 넉넉하면 열린 벡터가 스스로 닫히거나 다른 벡터와 붙기 전에 인서트를 만날 확률이 높아집니다.
예제 풀이
- 입력값: 벡터 50 ng, 벡터 3000 bp, 인서트 1000 bp, 몰비 3 : 1입니다.
- 길이 비 = 1000 ÷ 3000 = 0.3333입니다.
- 1 : 1일 때 인서트 = 50 × 0.3333 = 16.67 ng입니다.
- 3 : 1일 때 인서트 = 16.67 × 3 = 50 ng입니다.
| 벡터 길이 (bp) | 필요한 인서트 (ng) |
|---|---|
| 750 | 200 |
| 1,500 | 100 |
| 2,250 | 66.66666667 |
| 3,000 | 50 |
| 3,750 | 40 |
| 4,500 | 33.33333333 |
| 6,000 | 25 |
결과 해석
점착 말단 라이게이션에서는 인서트 : 벡터 = 3 : 1이 흔한 출발점입니다. 여러 프로토콜이 1 : 1에서 10 : 1 정도까지 범위를 시험해 보길 권하며, 아주 짧은 인서트나 평활 말단은 더 큰 과량이 유리한 경우가 많습니다. 계산값이 1 ng도 안 될 만큼 작으면 인서트를 희석해 정확히 피펫팅할 수 있게 하시고, 너무 크면 리가아제 제조사가 권하는 총 DNA 양을 넘지 않도록 벡터 양을 줄이시기 바랍니다.
흔한 실수
- 절단 후 일부 조각이 빠진 벡터인데 원래 플라스미드 길이를 넣는 경우
- 비율을 거꾸로 적용해 인서트를 벡터보다 적게 넣는 경우
- 겔 정제 전에 잰 농도를 그대로 쓰는 경우
자주 묻는 질문
여러 조각을 조립할 때도 쓸 수 있나요?
네. 각 조각을 벡터와 따로 계산하면 됩니다. 조립 키트는 보통 같은 몰수나 약간의 과량을 권합니다.
어닐링한 올리고처럼 아주 짧은 인서트는 몰비를 얼마로 하나요?
훨씬 큰 과량을 쓰는 경우가 많습니다. 키트 안내를 따르고 여러 비율을 시험해 보시기 바랍니다.
벡터 양을 pmol로 계산해도 되나요?
됩니다. pmol = ng × 1000 ÷ (bp × 618)로 바꾼 뒤 몰비를 곱하면 인서트 pmol이 나옵니다.
출처: New England Biolabs, NEBioCalculator, ligation calculator and T4 DNA ligase protocols · Sambrook, J. and Russell, D. W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)