홍라이프 계산기NGS 시퀀싱 커버리지 쉽게 이해하기 — 개념과 원리
시퀀싱 커버리지(깊이)는 유전체의 각 염기가 평균적으로 몇 번 읽혔는지를 나타내는 값입니다. 이 계산기는 유전체 크기, 리드 수, 리드 길이로 평균 커버리지를 구하고, 랜더-워터먼 모형으로 한 번 이상 읽힌 유전체의 비율을 추정합니다. 시퀀싱 분량을 얼마나 주문할지 계획하거나, 받은 데이터가 충분한지 확인할 때 씁니다.
계산 방법
- 평균 커버리지: C = N × L × E ÷ G (N은 리드 수(백만 단위 입력), L은 리드 길이(bp), E는 페어드엔드 2·싱글엔드 1, G는 유전체 크기(Mb 단위 입력))
- 1× 이상 덮인 비율: 1 − e^(−C)
페어드엔드를 선택하면 리드 수에 2를 곱하므로, 리드 쌍(클러스터·단편) 수를 입력해야 합니다. 이미 양쪽 리드를 모두 센 숫자라면 '아니요'를 선택하시면 됩니다.
원리
읽은 전체 염기 수는 N × L × E입니다. 이를 G개의 염기로 이루어진 유전체에 고르게 나누면 평균 깊이 C가 됩니다. 랜더와 워터먼은 리드가 무작위 위치에서 시작한다면 특정 염기를 덮는 리드 수가 평균 C인 푸아송 분포를 따른다는 점을 보였습니다. 그러면 한 번도 읽히지 않을 확률은 e^(−C)이고, 덮인 비율은 1 − e^(−C)입니다. 평균 1×에서는 약 63%만 덮이지만 5×이면 약 99.3%가 덮입니다.
예제 풀이
- 입력값: G = 3,100 Mb, N = 6억 리드 쌍, L = 150 bp, 페어드엔드
- 읽은 염기 수: 600 × 10⁶ × 150 × 2 = 1.8 × 10¹¹ bp(180 Gb)
- C = 1.8 × 10¹¹ ÷ 3.1 × 10⁹ = 58.06×
- 덮이지 않을 비율 e^(−58.06)은 사실상 0이므로 1× 이상 덮인 비율은 100%입니다.
| 유전체 크기 (Mb) | 평균 커버리지 (×) |
|---|---|
| 775 | 232.2580645 |
| 1,550 | 116.1290323 |
| 2,325 | 77.41935484 |
| 3,100 | 58.06451613 |
| 3,875 | 46.4516129 |
| 4,650 | 38.70967742 |
| 6,200 | 29.03225806 |
결과 해석
평균 깊이는 계획용 숫자이고, 실제로 중요한 것은 위치별 깊이입니다. 사람 전장 유전체의 생식세포 변이 분석에는 약 30×가 널리 쓰이는 목표이며, 암 체세포 변이나 저빈도 변이 검출에는 훨씬 깊게 읽는 것이 일반적입니다. 이론상 100%가 나와도 반복 서열, GC 함량이 극단적인 구간, 매핑 실패 때문에 실제로는 빈 곳이 생깁니다.
흔한 실수
- 리드 쌍을 리드 2개로 센 숫자를 넣고 페어드엔드까지 선택해 커버리지를 두 번 부풀리는 경우
- 중복 리드, 어댑터 제거, 매핑되지 않은 리드로 줄어드는 유효 깊이를 무시하는 경우
- 엑솜이나 패널 시퀀싱에 전체 유전체 크기를 넣는 경우(표적 영역 크기를 써야 합니다)
자주 묻는 질문
사람 유전체를 30×로 읽으려면 리드가 얼마나 필요한가요?
30 × 3.1 × 10⁹ ÷ (150 × 2) ≈ 3.1억 쌍(2 × 150 bp)이며, 손실분은 별도로 더해야 합니다.
커버리지와 깊이는 같은 말인가요?
흔히 같은 뜻으로 쓰입니다. 덮인 염기의 비율은 따로 '커버리지 폭(breadth)'이라고 부릅니다.
페어드엔드 리드가 겹치면 왜 문제가 되나요?
단편 길이가 리드 길이의 두 배보다 짧으면 두 리드가 같은 염기를 중복으로 읽어 겉보기 깊이가 부풀려집니다.
출처: E. S. Lander and M. S. Waterman, "Genomic mapping by fingerprinting random clones", Genomics 2, 231–239 (1988) · D. Sims et al., "Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses", Nature Reviews Genetics 15, 121–132 (2014)