홍라이프 계산기프라이머 Tm·GC% 계산기 쉽게 이해하기 — 개념과 원리
프라이머의 용융 온도(Tm)는 프라이머 분자의 절반이 상보 가닥과 결합해 있는 온도입니다. PCR 어닐링 온도를 정하고, 정방향과 역방향 프라이머의 짝을 맞추고, 프로브를 설계할 때 기준이 됩니다. 이 계산기는 단일 가닥 DNA 올리고의 Tm 추정값 두 가지와 GC 함량, 길이, 분자량을 구해 줍니다.
계산 방법
- 염 보정 Tm = 81.5 + 16.6 log₁₀[Na⁺] + 0.41 × (%GC) − 600 ÷ N입니다. [Na⁺]는 mol/L(입력한 mM ÷ 1000), N은 염기 수입니다.
- 월리스 규칙: Tm = 2(A + T) + 4(G + C)로 염기 개수를 셉니다.
- GC 함량 = (G + C) ÷ N × 100입니다.
- 분자량 = 313.21·A + 304.2·T + 329.21·G + 289.18·C − 61.96 g/mol로, 5′ 인산이 없는 비수식 올리고 기준입니다.
A, C, G, T 이외의 문자는 무시합니다.
원리
G·C 쌍은 수소 결합이 세 개이고 염기 쌓임도 강해 두 개인 A·T 쌍보다 떼어 내는 데 열이 더 필요합니다. 이중 가닥이 길수록 접촉이 많아지지만 염기 하나가 더하는 효과는 점점 작아지는데, 이를 −600/N 항이 나타냅니다. 양이온은 음전하를 띤 인산 골격의 반발을 가려 주므로 염 농도가 높을수록 이중 가닥이 안정해지며, 로그 항이 이를 반영합니다. 월리스 규칙은 고염 조건의 짧은 올리고에 맞춘 간편식이라 긴 프라이머에서는 Tm을 높게 잡습니다. 이웃한 염기쌍의 안정도를 모두 더하는 최근접 이웃 모델이 더 정확합니다.
예제 풀이
- 서열 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA: N = 24, A = 10, T = 4, G = 5, C = 5입니다.
- GC = 10 ÷ 24 × 100 = 41.67%입니다.
- 염 보정: 81.5 + 16.6 × log₁₀(0.05) + 0.41 × 41.67 − 600 ÷ 24 = 81.5 − 21.60 + 17.08 − 25.00 = 51.99 °C입니다.
- 월리스: 2 × 14 + 4 × 10 = 68 °C입니다.
- 분자량 = 10 × 313.21 + 4 × 304.2 + 5 × 329.21 + 5 × 289.18 − 61.96 = 7,378.89 g/mol입니다.
| Na⁺ (mM) | Tm, 염 농도 보정 (°C) |
|---|---|
| 12.5 | 41.99203955 |
| 25 | 46.98913748 |
| 37.5 | 49.91225238 |
| 50 | 51.98623541 |
| 62.5 | 53.59494162 |
| 75 | 54.90935031 |
| 100 | 56.98333333 |
결과 해석
흔히 쓰는 설계 기준은 길이 약 18~25 nt, GC 함량 약 40~60%, 두 프라이머의 Tm 차이 약 5 °C 이내입니다. 어닐링 온도는 낮은 쪽 Tm보다 몇 도 낮게 시작해 최적화하는 경우가 많습니다. 예제에서 두 추정값이 16 °C나 차이 나는 것은 월리스 규칙을 짧은 올리고에만 써야 하는 이유를 보여 줍니다. 실제 반응액에는 Tm을 높이는 Mg²⁺도 들어 있어 효소 회사 계산기 값이 더 높게 나올 수 있습니다.
흔한 실수
- 서로 다른 공식이나 도구에서 나온 Tm을 비교하는 경우
- Na⁺를 mM 대신 mol/L로 넣는 경우
- 첫 어닐링 온도를 정할 때 5′ 꼬리나 제한 효소 자리까지 포함하는 경우
자주 묻는 질문
효소 회사의 Tm 값과 다른 이유는 무엇인가요?
회사 도구는 보통 자사 버퍼 조건을 반영한 최근접 이웃 열역학을 쓰므로 이 값과 직접 바꿔 쓸 수 없습니다.
분자량으로 몰농도를 구하려면 어떻게 하나요?
질량 농도를 분자량으로 나눕니다. 이 올리고 7.38 µg/mL는 약 1 µM입니다.
출처: Wallace, R. B. et al. (1979), Nucleic Acids Research 6, 3543–3557 · SantaLucia, J. (1998), Proceedings of the National Academy of Sciences 95, 1460–1465 · Sambrook, J. and Russell, D. W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)