홍라이프 계산기A280 단백질 농도 쉽게 이해하기 — 개념과 원리
280 nm 흡광도 측정은 정제된 단백질의 농도를 구하는 가장 빠른 방법입니다. 시약이 필요 없고 시료도 다시 회수할 수 있습니다. 이 계산기는 측정한 A280 값에 단백질의 몰 흡광계수와 분자량을 넣어 베르-람베르트 법칙으로 mg/mL와 µM 농도를 계산합니다. 기본값은 소 혈청 알부민(BSA)입니다.
계산 방법
- 몰농도: c(M) = A ÷ (ε × l)
- µM 농도: c × 10⁶
- mg/mL 농도: c × MW (mol/L × g/mol = g/L이고, 1 g/L = 1 mg/mL)
A280은 단위가 없고, ε의 단위는 M⁻¹cm⁻¹, l은 빛이 지나는 거리(표준 큐벳은 1 cm), MW는 Da(g/mol)입니다.
원리
베르-람베르트 법칙에 따르면 흡광도는 빛을 흡수하는 물질의 농도와 빛이 통과하는 거리에 비례합니다(A = εcl). 280 nm에서 단백질의 흡광은 대부분 트립토판과 타이로신의 방향족 곁사슬에서 나오고, 이황화 결합(시스틴)이 조금 더해집니다. 그래서 단백질마다 고유한 ε 값이 있으며, 실험으로 재거나 아미노산 서열로 예측할 수 있습니다. 법칙을 정리하면 c = A ÷ (εl)이 됩니다.
예제 풀이
- 입력값: A280 = 0.8, ε = 43,824 M⁻¹cm⁻¹, MW = 66,430 Da, l = 1 cm
- c = 0.8 ÷ (43,824 × 1) = 1.8255 × 10⁻⁵ M = 18.25 µM
- 질량 농도: 1.8255 × 10⁻⁵ mol/L × 66,430 g/mol = 1.2127 g/L = 1.213 mg/mL
| 몰 흡광계수 (M⁻¹cm⁻¹) | 농도 (mg/mL) |
|---|---|
| 10,956 | 4.850675429 |
| 21,912 | 2.425337714 |
| 32,868 | 1.61689181 |
| 43,824 | 1.212668857 |
| 54,780 | 0.9701350858 |
| 65,736 | 0.8084459048 |
| 87,648 | 0.6063344286 |
결과 해석
ε ÷ MW는 1 mg/mL 용액의 흡광도로, 이 BSA 값에서는 약 0.66입니다. 따라서 A280 0.8은 약 1.2 mg/mL에 해당합니다. 트립토판이 많은 단백질은 이 값이 훨씬 큽니다. 측정값이 기기 측정 범위의 중간쯤일 때 가장 믿을 만하므로, 너무 높게 나오면 희석하고 진한 시료는 광로가 짧은 큐벳을 사용합니다. A260/A280 비율을 보면 핵산 오염을 확인할 수 있는데, 핵산은 260 nm에서 강하게 흡수하며 A280도 높여 농도를 과대평가하게 만듭니다.
흔한 실수
- 단백질이 녹아 있는 것과 같은 완충액으로 바탕 보정(블랭크)을 하지 않는 경우
- 이황화 결합이 형성된 단백질에 환원형 ε를 쓰거나 그 반대로 쓰는 경우
- 탁한 시료를 측정하는 경우(빛 산란으로 흡광도가 높게 나옵니다)
- 측정 전에 희석했는데 희석 배수를 곱하지 않는 경우
자주 묻는 질문
흡광계수는 어디서 구하나요?
Pace 방법이나 ExPASy ProtParam 같은 도구로 서열에서 계산하거나, 문헌에 보고된 실험값을 사용하시면 됩니다.
'A280 0.1%'는 무슨 뜻인가요?
1 mg/mL(0.1% w/v) 용액을 1 cm 광로로 잰 흡광도로, ε ÷ MW와 같습니다.
세포 용해액 같은 단백질 혼합물에도 쓸 수 있나요?
혼합물에는 하나의 ε가 없으므로 정확하지 않습니다. 브래드퍼드나 BCA 정량법을 권합니다.
출처: C. N. Pace, F. Vajdos, L. Fee, G. Grimsley and T. Gray, Protein Science 4, 2411–2423 (1995) · E. Gasteiger et al., "Protein identification and analysis tools on the ExPASy server", The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)