홍라이프 계산기단백질 흡광계수·분자량 쉽게 이해하기 — 개념과 원리
A280으로 단백질 농도를 재려면 몰 흡광계수 ε가 필요하고, 몰농도를 mg/mL로 바꾸려면 분자량이 필요합니다. 이 계산기는 한 글자 기호로 적은 아미노산 서열에서 두 값을 모두 예측합니다. 트립토판, 타이로신, 시스테인 개수를 세어 Pace 등(1995)의 계수를 적용하고, 잔기의 평균 질량을 더해 분자량을 구합니다. 표준 아미노산 기호가 아닌 문자는 무시합니다.
계산 방법
- ε280(시스테인 환원형) = 5,500 × nW + 1,490 × nY (M⁻¹cm⁻¹)
- ε280(모든 시스테인이 시스틴) = 5,500 × nW + 1,490 × nY + 125 × ⌊nC ÷ 2⌋ — 이황화 결합 하나에 시스테인 두 개가 쓰이기 때문입니다.
- 평균 분자량 = 잔기 질량의 합 + 18.015 Da — 사슬 양 끝(N 말단, C 말단)에 해당하는 물 분자 하나를 더합니다.
- 길이: 계산에 쓰인 잔기 수
원리
280 nm에서는 트립토판의 인돌 고리가 강하게 흡수하고, 타이로신의 페놀 고리는 그 4분의 1 정도, 이황화 결합은 약하게 흡수합니다. 나머지 잔기는 거의 흡수하지 않습니다. Pace 연구진은 농도를 아는 여러 단백질을 측정해, 접힌 단백질의 물속 값으로 이 세 가지 기여를 더하면 ε를 잘 예측할 수 있음을 보였습니다. 잔기 질량은 아미노산 질량에서 물 하나를 뺀 값입니다. 펩타이드 결합이 생길 때마다 물이 한 분자씩 빠져나가기 때문이며, 사슬 전체에 대해 물 하나를 다시 더합니다.
예제 풀이
- 서열: MKWVTFISLLLLFSSAYS(18잔기, 소 혈청 알부민 전구체의 신호 펩타이드)
- 개수: W = 1, Y = 1, C = 0
- ε280 = 5,500 × 1 + 1,490 × 1 = 6,990 M⁻¹cm⁻¹, 시스테인이 없으므로 시스틴 기준값도 6,990입니다.
- 잔기 질량 합: M 131.19 + K 128.17 + W 186.21 + V 99.13 + T 101.11 + F 2 × 147.18 + I 113.16 + S 4 × 87.08 + L 4 × 113.16 + A 71.08 + Y 163.18 = 2,088.54 Da
- 분자량 = 2,088.54 + 18.02 = 2,106.55 Da, 길이 = 18
결과 해석
이황화 결합을 이루는 단백질(비환원 조건의 세포 밖 단백질 대부분)은 시스틴 기준값을, 세포 안 단백질이나 DTT·TCEP가 들어 있는 시료는 환원형 값을 쓰시면 됩니다. ε를 분자량으로 나누면 1 mg/mL 용액의 A280이 되어 빠른 환산에 편리합니다. Trp와 Tyr가 전혀 없는 단백질은 280 nm 흡광계수가 거의 0이므로 A280 정량을 쓸 수 없습니다.
흔한 실수
- 정제 단백질에는 없는 신호 펩타이드나 태그까지 포함한 서열을 넣는 경우
- 자유 시스테인이 있는 단백질에 시스틴 기준값을 쓰는 경우
- 예측 분자량에 당쇄나 다른 변형이 포함되어 있다고 생각하는 경우
자주 묻는 질문
왜 단일동위원소 질량이 아니라 평균 질량을 쓰나요?
농도 계산에는 평균 질량이 맞고, 질량분석에는 단일동위원소 질량이 주로 필요합니다.
변성된 단백질도 ε가 같나요?
완전히 같지는 않습니다. 풀리면 방향족 잔기의 흡수가 조금 달라지며, Gill과 von Hippel은 변성 단백질 기준의 방법을 제시했습니다.
시스틴 하나에 125는 큰 값인가요?
대개 작지만, 방향족 잔기가 적고 이황화 결합이 많은 단백질에서는 무시할 수 없습니다.
출처: C. N. Pace, F. Vajdos, L. Fee, G. Grimsley and T. Gray, Protein Science 4, 2411–2423 (1995) · S. C. Gill and P. H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319–326 (1989)