홍라이프 계산기qPCR ΔΔCt 발현 배수 계산기 쉽게 이해하기 — 개념과 원리
ΔΔCt(비교 Ct) 방법은 실시간 PCR로 상대적 유전자 발현량을 나타낼 때 가장 널리 쓰는 방법입니다. 처리 시료와 대조 시료에서 표적 유전자를 기준(하우스키핑) 유전자와 비교한 뒤, 그 차이를 발현 배수로 나타냅니다. 이 계산기는 ΔΔCt, 발현 배수, log₂ 값을 구하며 증폭 효율도 반영할 수 있습니다.
계산 방법
- ΔCt(처리) = 표적 Ct − 기준 Ct(처리 시료), ΔCt(대조)도 대조 시료에서 같은 방식으로 구합니다.
- ΔΔCt = ΔCt(처리) − ΔCt(대조)입니다.
- 발현 배수 = (1 + E)^(−ΔΔCt)이며 E는 효율을 소수로 나타낸 값입니다. 효율 100%면 E = 1이 되어 고전적인 2^(−ΔΔCt)가 됩니다.
- log₂ 발현 배수 = −ΔΔCt × log₂(1 + E)입니다.
원리
지수 증폭 구간에서는 한 사이클마다 산물이 (1 + E)배가 됩니다. Ct는 형광이 정해진 역치를 넘는 사이클이므로, 처음 주형이 많을수록 더 일찍 도달합니다. 효율이 100%라면 한 사이클 빠를 때 주형이 약 두 배 많다는 뜻입니다. 기준 유전자 Ct를 빼면 각 웰에 들어간 RNA나 cDNA 양의 차이가 보정되고, 여기서 대조군 ΔCt를 빼면 처리군을 대조군에 대한 상대값으로 나타낼 수 있습니다. Ct가 낮을수록 주형이 많으므로 지수에 음의 부호가 붙습니다.
예제 풀이
- 입력값: 처리군 표적 24, 기준 18, 대조군 표적 26, 기준 18, 효율 100%입니다.
- ΔCt(처리) = 24 − 18 = 6, ΔCt(대조) = 26 − 18 = 8입니다.
- ΔΔCt = 6 − 8 = −2입니다.
- 발현 배수 = 2^(−(−2)) = 2² = 4입니다.
- log₂ 발현 배수 = 2 × log₂ 2 = 2입니다.
| 표적 유전자 Ct, 대조군 | 발현 배수 (fold change) |
|---|---|
| 6.5 | 0.0000053948 |
| 13 | 0.0004882813 |
| 19.5 | 0.0441941738 |
| 26 | 4 |
| 32.5 | 362.038672 |
| 39 | 32,768 |
| 52 | 268,435,456 |
결과 해석
발현 배수 1(log₂ = 0)은 차이가 없다는 뜻입니다. 1보다 크면 발현 증가, 0과 1 사이면 감소이며, 예를 들어 0.25는 4배 감소(log₂ = −2)입니다. log₂ 척도는 증가와 감소가 대칭이라 생물학적 반복의 평균과 통계 분석에 주로 씁니다. Ct가 0.5 사이클만 달라져도 약 1.4배 차이가 나므로, 두 배 미만의 작은 변화는 반복 실험이 충분해야 설득력이 있습니다.
흔한 실수
- 처리군과 대조군을 바꿔 넣어 발현 배수가 역수로 나오는 경우
- ΔCt나 log₂ 값이 아니라 발현 배수를 그대로 평균하는 경우
- 처리에 따라 발현이 변하는 유전자를 기준 유전자로 쓰는 경우
- 표적과 기준 유전자의 효율이 크게 다른데 2^(−ΔΔCt)를 쓰는 경우
자주 묻는 질문
표적과 기준 유전자의 효율을 따로 넣을 수 있나요?
이 식은 ΔΔCt에 효율 하나만 적용합니다. 효율이 다르면 E표적^ΔCt(표적) ÷ E기준^ΔCt(기준) 형태의 Pfaffl 비를 씁니다.
기준 유전자는 몇 개를 써야 하나요?
검증된 기준 유전자 두 개 이상을 쓰고 그 기하 평균으로 정규화하는 연구가 많습니다.
오차는 어떻게 표시하나요?
ΔCt나 ΔΔCt에서 표준 편차를 구한 뒤 범위를 배수로 바꿉니다. 이렇게 얻은 배수 구간은 비대칭입니다.
출처: Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. (2001), Methods 25, 402–408 · Pfaffl, M. W. (2001), Nucleic Acids Research 29, e45 · Bustin, S. A. et al. (2009), Clinical Chemistry 55, 611–622 (MIQE guidelines)